Restriction enzyme (좀 더 정확한 용어는 restriction endonuclease; 약자로 RE)은 DNA의 특정 sequence를 인식하여 잘라주며, 1970년 Hamilton Smith (나중에 그 공으로 노벨상 수상)에 의해 처름으로 동정되었다.
　RE의 명명은 동정된 균주의 이름을 따른다. 가령 EcoRⅠ의 경우 Escherichia coli RY13 strain에서 동정되었다. 따라서 EcoRⅠ의 처음 E는 Escherichia에서, co는 coli에서, R은 strain 이름 RY13에서,Ⅰ은 맨처음 동정되었다는 의미이다. 막 처음 실험실에 들어와서 EcoRⅠ을 “이코알아이”라고 읽었다가 망신당한 적이 있다. 맨 마지막 “Ⅰ”는 숫자이므로 “one”이라고 읽어야 한다. 그리고 개인의 취향에 따라 다르긴 하지만, RE에 따라 편하게 읽는 방법을 선호하는 경우도 있다. 가령 BglⅡ를 “비지엘투”대신에 “베이글투”라고 읽기도 하며, 나는 “베이글투”로 읽는 방식을 선호한다. 좀 더 친숙하게 느껴지기 때문이다. 빵이 생각나므로.

Ⅰ클로닝이란?

1.1. 클로닝의 정의 17

1.2. 새로운 유전자의 발굴 18

1.3. 과거의 클로닝 20

1.4. 현재의 클로닝 21



Ⅱ 클로닝을 위한 준비

2.1. 클로닝 설계에 유용한 소프트웨어 27

2.2. Vector, Plasmid, Construct & Kozak consensus sequence 31

2.3. Multiple Cloning Sites (MCS) 36

2.4. 제한효소 (Restriction enzyme; RE)와 Star activity 39

2.5. Agarose gel electrophoresis for nucleic acids 47

2.6. LB (Luria-Bertani) plate 만들기 52

2.7. Competent cells 55

2.8. DNA의 질량을 molar 농도로 바꾸는 법 59

2.9. 새로운 plasmid를 받았을 때 60

2.10. cDNA library 62



Ⅲ 클로닝 첫걸음

3.1. Cut & Paste 67

3.2. DNA sequencing & Direct sequencing 80

3.3. 클로닝을 위한 PCR & Nested PCR 85

3.4. Fill-in (Full & Partial) 94

3.5. Compatible cohesive ends 98

3.6. Methylation 100

3.7. Three-piece ligation 109

3.8. Site-directed mutagenesis 112

3.9. 식물 형질 전환 (Plant transformation) 벡터의 구조 119

3.10. rhizobium radiobacter 형질 전환 123



Ⅳ 클로닝 다음 걸음

4.1. 유전자 중간부분에 다른 DNA를 삽입하는 방법 (Insertion)

4.2. 유전자 중간부분을 삭제하는 방법 (Deletion) 131

4.3. 유전자에 epitope tag을 삽입하는 방법 & CRISPR/Cas9 133

4.4. Translational fusion vs. transcriptional fusion 139



Ⅴ 클로닝 마지막 걸음

5.1. 다른 종에서 유사한 유전자를 cloning하는 방법 143

5.2. RACE (rapid amplification of cDNA ends) 146

5.3. BAC recombineering 149

5.4. Old Trick: partial digestion 153

5.5. 벡터의 변경 155

5.6. 클로닝이 다 됐다고 생각했는데, frame shift가 있을 때 158

5.7. 클로닝의 실제: 억세게 운이 없는 경우 160



Ⅵ 클로닝으로 인한 두통을 덜어주는 방법

6.1. TA cloning & T-vector의 제작 173

6.2. TOPO TA cloning 179

6.3. Gateway cloning 182

6.4. Golden gate assembly & Golden gate를 이용해 푸는 직소퍼즐 185

6.5. In-Fusion Sequence-and Ligation-independent Cloning (In-Fusion SLC) 192

6.6. T4 DNA Polymerase Sequence-and Ligation-Independent Cloning (T4 DNA Pol SLIC) 205

6.7. Non-template PCR cloning 211



Ⅶ Cloner에게 주는 조언

7.1. 클로닝이 안될 때 217

7.2. 클로닝의 정리와 기록 220



Appendix 1. 심화학습을 위한 문헌 224

Appendix 2. 약자 226

Appendix 3. index 228